El informe en Inmunofenotipificación de leucemias y linfomas: la información más allá de la de la conclusión citométrica

Gabriel Tamayo, centro especializado en patología oncohematológica, Synlab Colombia.

El desarrollo y estandarización de nuevas herramientas de diagnóstico en el campo de las neoplasias malignas hematológicas, ha permitido realizar diagnósticos cada vez más rápidos y precisos.  Una de estas herramientas es la citometría de flujo (CMF), metodología de elección para el inmunofenotipaje de leucemias y de linfomas.  

A pesar de la creciente importancia de las características moleculares y genéticas en la subclasificación de las neoplasias hematológicas, los análisis morfológicos e inmunofenotípicos por citometría de flujo (CMF) siguen siendo las modalidades principales mediante las cuales se evalúan por primera vez estas enfermedades, principalmente en nuestro país donde el acceso a pruebas complementarias es limitado.     

En los últimos años, los grupos de trabajo en citometría han realizado avances fundamentales principalmente dirigidas a la estandarización de procesos. Es por esto, que la la información obtenida es cada vez más compleja y tiene algunas particularidades que es necesario conocer.  Específicamente, hay muchos aspectos dentro del informe que deben ser interpretados con precaución y que pueden dar pistas desde el procedimiento técnico, de la calidad de la muestra, e incluso la información con valor pronóstico

La muestra

Clásicamente se ha utilizado solo sangre medular para el análisis inmunofenotípico; sin embargo, los avances en técnicas de procesamiento permiten abrir un abanico de posibilidades para el diagnóstico en otro tipo de muestras.

Un ejemplo importante es poder realizar un análisis por CMF en aspirados “secos” a partir de cilindros óseos o tejidos como ganglio linfático.   En este tipo de casos solo sería posible realizar diagnóstico o seguimiento a través de estudio histológico, que por su naturaleza conlleva más tiempo debido a los múltiples pasos técnicos. Adicionalmente, en ocasiones es necesario realizar pruebas de inmunohistoquímica complementarias para detectar células patológicas lo que pospone aún más el tiempo de un valioso informe.      

En estas muestras a través de procesos de maceración y disgregación/filtrado se puede obtener muestra para CMF y así acelerar el proceso diagnóstico.   Para ejecutar esto, es necesario contar con citómetros de flujo de por lo menos 8 colores para obtener alta especificidad, información a corroborar en el fragmento del reporte que describe los anticuerpos utilizados para el análisis. 

Se han reportado concordancias de hasta el 94% en CMF en cilindro óseo en comparación con muestras de aspirado, principalmente para leucemias agudas(1). En el caso de ganglio linfático se han reportado correlaciones en relación al estudio histológico del 81%(2).

Una fuente valiosa de información son los líquidos corporales. Para este tipo de muestras, el grupo de consenso ha diseñado estrategias técnicas que permitan recuperar de forma adecuada los pocos eventos celulares y así obtener una buena sensibilidad, especialmente en líquido cefalorraquídeo. En este tipo de muestra también se requiere de protocolos técnicos adicionales que permitan asegurar este objetivo, con el uso de hasta 12 anticuerpos por tubo (alta especificidad) e incluso el uso de centrifugas especiales (no angulares).   El uso de la CMF ha incrementado notablemente la detección de hematopatías en esta fuente de análisis potencializando la sensibilidad de la citología convencional, logrando incrementar la sensibilidad del 2-30% hasta el 80%(3).

Fechas en el informe

La adquisición es la acción de pasar células marcadas con anticuerpos monoclonales por el citómetro, que es el producto final de la técnica de procesamiento celular. Es importante tener en cuenta este dato ya que permite inferir el tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y el procesamiento final. Si bien se ha reportado que las muestras para estudio citométrico son estables por 72 horas, es importante resaltar que dependiendo de la células a estudiar, la entidad, la temperatura de almacenamiento, el tipo de anticoagulante, y el tipo de muestra a estudiar este tiempo puede sufrir variaciones(4).  Las muestras con infiltraciones con linfomas de algo grado de tipo Burkitt o las neoplasias de células plasmáticas pueden tener estabilidades inferiores a lo descrito.   También se ha reportado que los linfocitos son más estables en la variación antigénica que los neutrófilos o monocitos(5).

Si bien el uso de estabilizantes puede incrementar la estabilidad hasta en 10 días, se recomienda utilizarlo principalmente en líquidos corporales o muestras susceptibles de retraso operativo debido a que puede disminuir  la expresión de algunos antígenos(5). Para asegurar un rápido procesamiento, es importantísimo tener en cuenta que el procesamiento de la muestra depende de los datos clínicos aportados. Una historia clínica completa es indispensable para iniciar el proceso técnico.

Especificidad – paneles utilizados

La especificidad en citometría se basa en la capacidad de detectar una célula problema entre otras normales, y es por esto que a más anticuerpos utilizados hay mayor capacidad de detectar dichas células.  Cada combinación de marcadores debe diseñarse para responder a una o múltiples preguntas clínicas mediante la identificación, enumeración y caracterización de las poblaciones de células relevantes en una muestra.     Esta configuración de diferentes proteínas en un solo tubo y su cantidad es  a lo que popularmente llamamos “colores”;  un panel a 8 o 12 colores, contendrá más anticuerpos que uno de 4, siendo más específico.   Con este propósito, Euroflow empezó a diseñar paneles de anticuerpos de 8 colores validados para inmunofenotipificación de neoplasias hematológicas en búsqueda de incrementar la estandarización y la  especificidad(6).

Los reportes de citometria generalmente tienen un apartado donde se describen los anticuerpos monoclonales utilizados para el estudio de la muestra analizada y es esto lo que nos permite conocer que tan específico fue el análisis, así como, conforme a lo descrito, si son diseñados con base en el consorcio Euroflow.  Esto garantiza la reproducibilidad en el diagnóstico y seguimiento adecuado entre instituciones. 

Diagrama de flujo de la estrategia EuroFlow para la caracterización inmunofenotípica de neoplasias hematológicas. Basado y adaptado de Euroflow(6)

La evaluación de sensibilidad

La citometría de flujo se ha convertido en un método muy valioso para monitorear la enfermedad residual mínima (EMR), principalmente en el mieloma múltiple (MM) y  la leucemia linfoblástica B (LLAB).  

La sensibilidad en citometria es la capacidad de identificar una célula problema entre muchas normales, y es por esto por lo que a más células analizadas hay mayor capacidad de detectar dichas células.   Hace algunos años se reportó un enfoque de CMF de próxima generación (NGF) para la detección de EMR altamente sensible y estandarizada en MM y LLAB(7).  Este estudio, analizando hasta 5 millones de células, reportó que el 25% de los pacientes clasificados como EMR negativos por CMF convencional de 8 colores fueron EMR positivos por NGF, lo que se traduce en una supervivencia libre de progresión significativamente más corta en comparación a lo que fueron EMR negativos por NGF(8), demostrando la importancia de contar con métodos altamente sensibles.   

Estos estudios establecen la sensibilidad como el parámetro fundamental en la NGF; adicionalmente es útil en cualquier evaluación citométrica de alta sensibilidad como en el caso de la CMF para hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN)(9). Para evaluar de forma precisa esta información es necesario tener claros dos conceptos que son generalmente reportados y que permiten evaluar la calidad de la interpretación

  • Límite de detección: LOD:  Es la probabilidad de encontrar un cierto número de eventos sea mayor de lo que se esperaría en un individuo normal, es decir, que la población patológica esté presente. Da pistas sobre la SENSIBILIDAD del ensayo.    
  • Límite de cuantificación: LOQ:  Se refiere a la precisión con la que se puede determinar el porcentaje real de células patológicas entre operadores, de modo tal que el valor reportado en porcentaje sea reproducible, a pesar de cambiar de analista.   Da pistas sobre la PRECISIÓN del ensayo.

Estos porcentajes deberían ser superados por la población anormal para que sea reportada como estadísticamente adecuada.

Por ejemplo, 

  • Ejemplo 1.: LOD 0,0004% , total de células analizadas = 5,000,000, células anormales <0.0004%).   En este caso la prueba tiene una sensibilidad adecuada de 0.0004% y no se hallaron células anormales.
  • Ejemplo 2: LOD 0,0004%, LOQ 0,001%; células anormales= 0.0029% (145 células) total de células analizadas = 5,000,000).   En este caso la prueba tiene una sensibilidad adecuada de 0.0004% y el valor de células anormales reportadas, al ser superior al LOQ, es un valor preciso.
  • Ejemplo 3: células anormales detectados por debajo del rango cuantitativo (LOD: 0,0004 LOQ: 0,001%; células anormales = 35, total de células analizadas = 5,000,000).  En este caso a pesar de que se detectan células anormales con una sensibilidad superior al 0.0004% no es preciso determinar su valor.

El recuento diferencial 

El diferencial además de brindarnos información sobre el porcentaje de poblaciones y la magnitud de la población patológica si existiera, también nos da pistas sobre la calidad de la muestra y su grado de dilución.   Así un diferencial que reporte eritroblastos, mastocitos y células plasmáticas, es sugestivo de tener muestra con adecuada representación medular; por el contrario, valores ausentes de dichas poblaciones es sugestivo de hemodilución con sangre periférica.

Otro punto para tener en cuenta es el reporte que usualmente se hace de “viabilidad”.   Este reporte se debe tomar con precaución ya que este dato se toma de los eventos celulares con baja complejidad y tamaño (similar a restos celulares) por lo que se infiere que allí se encuentran células muertas.   Sin embargo, muchas de los eventos que presentan estas características son grasa, restos de eritrocitos, plaquetas y eritrocitos, es decir, este valor generalmente está sobrevalorado por lo que no es un indicador directo de la calidad de la muestra. Es por este motivo que muchas instituciones están cambiando este término a celularidad. 

La descripción fenotípica

Entendemos que esta información puede ser algo compleja y “no contributiva” para el clínico tratante, sin embargo, es sumamente útil para que las citometrías de seguimiento tracen adecuadamente la población a rastrear o para describir pistas fenotípicas con valor pronóstico.   

Un ejemplo lo constituye la leucemia promielocítica aguda (LPA) en donde los eventos hemorrágicos graves constituyen una fuente importante de muerte temprana. En este caso, la detección de CD203c en células patológicas puede ser un importante factor predictivo de este desenlace.  Se ha observado que la expresión de este marcador en pacientes con LPA indica un riesgo superior 26,4 veces de presentar hemorragia comparado con aquellos que no lo expresan(10).   En otro ejemplo, la expresión del antígeno CD56 en blastos de LPA se ha asociado con una duración corta de la remisión y una recaída extramedular con una tasa de recaída a 5 años del 22%, en comparación con una tasa de recaída del 10% para CD56 negativos(11).    En las CMF de seguimiento, encontrar alguno de estos dos marcadores es indicativo de la atipia de los promielocitos encontrados.

En conclusión, la descripción puntual de los marcadores expresados es útil para hacer un seguimiento preciso de la enfermedad a través del tratamiento; adicionalmente permite establecer factores pronósticos al momento del diagnóstico.

Por último, también ha sido útil el uso de puntajes citométricos como herramienta diagnóstica en CMF (12,13).    En estos sistemas se ordena el análisis de aberraciones citométricas según su importancia y a las cuales se le asigna una puntuación. La suma de ellas puede discriminar por ejemplo síndromes mielodisplásicos de citopenias no clonales con sensibilidades reportadas que van desde el 72 hasta el 86% y especificidades que van desde el 89% al 100%(12,14).    Este tipo de puntuaciones pueden ser bastante útiles cuando los SMD son de bajo grado y no presentan alteraciones típicas como incremento de blastos, sideroblastos en anillo o alteraciones citogenéticas aberrantes y propias de SMD(15).   El puntaje más mencionado es el puntaje de Ogata(13,16), el cual tiene una sensibilidad del 70% y una especificidad del 93% en pacientes con SMD de bajo riesgo con respecto a controles con citopenia, cuando la puntuación  es igual o superior a 2  (15).    Por lo anterior, el uso de puntajes citométricos es una herramienta potente para tener en cuenta en los informes.

Si bien la citometría de flujo puede generar muchísima información, es al final del informe, posterior a la conclusión, que el profesional encargado de generar el mismo quien debe resumir estos hallazgos.   Es necesario expresar que el diagnóstico hematopatológico debería ser integral, es decir, las personas que construyen este reporte deberían tener acceso, adicional a la información clínica, a la información de mielograma, biopsia, cariotipo y pruebas complementarias, para así construir un resumen más preciso.   

En conclusión, el reporte citométrico en clasificación inmunológica de leucemias y linfomas va más allá de los renglones finales de conclusión, y es necesario ahondar en los datos descritos en el reporte para sacar el máximo provecho de la información reportada.

Referencias

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  2. Bezerra AMPS, Pasqualin D da C, Guerra JC de C, Colombini MP, Velloso EDRP, Silveira PAA, et al. Correlation between flow cytometry and histologic findings: ten year experience in the investigation of lymphoproliferative diseases. Einstein (São Paulo) [Internet]. 2011 Jun [cited 2020 Oct 8];9(2):151–9. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26760808/
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  4. Davis BH, Dasgupta A, Kussick S, Han JY, Estrellado A. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS – Part II – Preanalytical issues. Cytom Part B – Clin Cytom. 2013;84(5):286–90. 
  5. Diks AM, Bonroy C, Teodosio C, Groenland RJ, de Mooij B, de Maertelaere E, et al. Impact of blood storage and sample handling on quality of high dimensional flow cytometric data in multicenter clinical research. J Immunol Methods. 2019 Dec 1; 
  6. van Dongen JJM, Lhermitte L, Böttcher S, Almeida J, van der Velden VHJ, Flores-Montero J, et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia [Internet]. 2012 Sep [cited 2013 Sep 30];26(9):1908–75. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3437410&tool=pmcentrez&rendertype=abstract
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